熒光是George Gabriel Stokes于1852年首次報道的一種現象。他觀察到螢石在紫外線照射后開始發光。熒光是光致發光的一種形式，是指一種材料被光照射后會發射出光子。發射光的波長比激發光更長。這種效應又稱為斯托克斯位移。

　　熒光在顯微鏡中有著廣泛的應用，是觀察特定分子分布的重要工具。細胞中的絕大多數分子并不會發出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進行標記。對于感興趣的分子可以直接標記（例如，用DAPI標記DNA），或者使用可與特異性抗體偶聯的熒光素進行免疫染色。免疫染色時通常必須對細胞進行固定。

　　熒光顯微鏡還可對活細胞或組織進行延時成像。為此，對于感興趣的蛋白質可以使用基因編碼的熒光分子進行標記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對于感興趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結合的合成染料（如fura-2）或轉基因天然蛋白質（如GFP衍生物）進行標記。

　　熒光的機制原理

　　熒光素只有在用對應波長的光照射下才會發出熒光。波長取決于熒光團的吸收光譜，必須確保輸送適當量的能量才能將電子提升至激發態。電子激發后只能在這種高能狀態下停留很短的時間。當電子弛豫到基態或其他能級較低的狀態時，能量則以光子的形式釋放出來。由于該過程中會出現一定的能量損失，因此與吸收的光相比，熒光素所發射出的光波長更長且能量更低。

　　磷光的機制原理

　　由于磷光分子發光的時間比熒光素長得多，因此它們儲存激發能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎在于兩種形式的激發能級，即單重激發態和三重激發態都基于不同的自旋排列。

　　自旋是電子的一種屬性。簡單來說，自旋描述了由電子旋轉引起的角動量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負方向（?1/2）。更高能級的自旋配對可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對中，單個角動量相互補償，同時自旋總值為零。這種自旋排列就稱為單重態。兩種平行自旋互不補償且所得數值不同于零值，在這種情況下，自旋被稱為三重態。

　　當電子從單重態激發態回到基態時，就會產生熒光。但在某些分子中，被激發電子的自旋可以在一種稱為系統間交叉的過程中轉換為三重態。這些電子失去能量，直到它們處于三重基態。這種態比基態具有更高的能量，但也比單重態激發態具有更低的能量。因此，電子無法切換回單重態，也不能輕易地返回基態，因為量子力學只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態當中。

　　但從三重基態到基態的一些變化有時還是有可能的。這些變化會發射出光子和磷光。由于一次只有少數事件可能發生，三重基態呈現為能量儲庫的形式，因此能夠在更長的一段時間內發出磷光。

　　冷發光在顯微鏡中的應用

　　對于顯微鏡，熒光是最為實用的一種冷發光。熒光素可以很容易地通過特定的光源（如燈和濾光系統或激光器）在特定波長下激發，發射光和激發光可以通過波長來加以區分（斯托克斯位移）。

　　利用熒光成像，實驗室人員可以對細胞內的分子數量和位置進行特征描述。熒光顯微鏡的另一個優點是可以同時使用幾種熒光素。熒光素只需其激發和發射波長不同即可。因此，不同目標分子均可同時觀察并開展大量的實驗，例如開展共定位的研究等。